肝癌細(xì)胞如何"銅墻鐵壁"抵抗死亡？HBV蛋白X破解線粒體銅代謝密碼

一、研究背景

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球重大公共衛(wèi)生問題，約有2.96億人處于慢性感染狀態(tài)，HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌（HCC）每年導(dǎo)致超過80萬人死亡。HBV編碼的X蛋白（HBx）通過重塑宿主轉(zhuǎn)錄和信號網(wǎng)絡(luò)、調(diào)控多種程序性細(xì)胞死亡（如凋亡、鐵死亡、壞死性凋亡、焦亡等）促進(jìn)惡性進(jìn)展和治療抵抗。

銅死亡（Cuproptosis）是2022年Tsvetkov等人新近定義的一種銅依賴的、以線粒體為中心的調(diào)控性細(xì)胞死亡形式，其特征是銅離子與脂酰化的三羧酸（TCA）循環(huán)蛋白結(jié)合，引發(fā)毒性聚集并破壞鐵硫簇，選擇性殺傷線粒體呼吸依賴型細(xì)胞。銅離子載體（如elesclomol, ES）可升高線粒體銅水平觸發(fā)銅死亡，而銅螯合劑（如四硫代鉬酸鹽, TTM）則拮抗此過程。然而，HBV是否通過HBx干擾銅穩(wěn)態(tài)和銅死亡以促進(jìn)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展，此前尚不清楚。

STEAP4（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4）是一種NADPH依賴的金屬還原酶，可將Cu2?/Fe3?還原為Cu?/Fe2?，在STEAP家族中具有最高的金屬攝取活性，是銅代謝和銅死亡敏感性的關(guān)鍵調(diào)控因子。臨床研究表明STEAP4在HCC中廣泛下調(diào)，且與晚期分期和不良預(yù)后相關(guān)。鑒于HBV感染患者血清銅水平升高，以及STEAP4在銅穩(wěn)態(tài)中的核心作用，本研究旨在闡明HBx是否通過調(diào)控STEAP4介導(dǎo)銅死亡逃逸，并探索靶向該通路的潛在治療策略。

二、研究內(nèi)容概述

1. STEAP4介導(dǎo)的銅代謝和銅死亡定義了HBV相關(guān)HCC的治療脆弱性

研究團(tuán)隊整合GEO（GSE62232、GSE135631、GSE121248、GSE94660）、TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP和CPTAC等多個公共數(shù)據(jù)庫，對127個銅代謝基因和10個核心銅死亡調(diào)控因子進(jìn)行差異表達(dá)分析和基因集富集分析（GSEA）。結(jié)果顯示，HBV陽性HCC中銅代謝和銅死亡相關(guān)基因集顯著下調(diào)，交叉隊列分析鑒定出STEAP4、HAMP、MT1H和SLC46A3四個核心差異基因，其中STEAP4的ROC曲線下面積（AUC=0.924）最高，提示其作為銅穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子的診斷價值。多隊列驗證（GSE121248、GSE94660、TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP、CPTAC-HCC）一致證實STEAP4在HBV相關(guān)HCC中顯著下調(diào)，且其表達(dá)與病理T分期呈負(fù)相關(guān)。臨床標(biāo)本分析（12對HBV-HCC癌與癌旁組織）顯示腫瘤組織中Cu2?含量顯著升高，而STEAP4蛋白水平顯著降低。組織微陣列（TMA）和生存分析進(jìn)一步證實低STEAP4表達(dá)與HBV陽性患者更差的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）相關(guān)。綜上，STEAP4缺失是HBV相關(guān)HCC的顯著分子特征，破壞了銅穩(wěn)態(tài)并削弱了銅死亡網(wǎng)絡(luò)。

2. 抗HBx通過上調(diào)STEAP4使HBV相關(guān)HCC細(xì)胞對ES誘導(dǎo)的銅死亡敏感化

在HBx轉(zhuǎn)基因（HBx-Tg）小鼠中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)顯示STEAP4和核心銅死亡調(diào)控因子FDX1下調(diào)，GSEA證實銅代謝和銅死亡信號通路受抑制，且肝組織Cu2?隨年齡增加而升高。HBx表達(dá)的HepG2細(xì)胞整合轉(zhuǎn)錄組/蛋白質(zhì)組學(xué)分析同樣顯示STEAP4一致下調(diào)，Venn交集分析將STEAP4確定為唯一的共享候選基因。功能實驗表明，HBx陽性HCC細(xì)胞系（HepG2.2.15、MHCC-97H）對ES-Cu誘導(dǎo)的銅死亡表現(xiàn)出部分耐受性。通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)抗HBx單克隆抗體（anti-HBx mAb）中和HBx后，細(xì)胞內(nèi)Cu2?降低而Cu?升高，總谷胱甘肽（T-GSH）增加，同時FDX1、LIAS、脂酰化DLAT減少，HSP70升高，DLAT寡聚體形成增加，呈現(xiàn)典型的銅死亡分子特征。多種細(xì)胞死亡抑制劑（氯喹、Fer-1、Nec-1、Z-VAD-FMK等）均不能挽救ES誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而銅螯合劑TTM可完全恢復(fù)細(xì)胞活力，證實該過程為銅依賴性銅死亡。因此，靶向HBx可恢復(fù)銅死亡敏感性，STEAP4是HBx驅(qū)動銅死亡抵抗的關(guān)鍵節(jié)點。

3. TTM逆轉(zhuǎn)STEAP4介導(dǎo)的ES誘導(dǎo)銅死亡敏感化和腫瘤抑制作用

研究團(tuán)隊在HepG2.2.15和MHCC-97H細(xì)胞中建立STEAP4穩(wěn)定敲低和過表達(dá)（STEAP4-OE）模型。STEAP4敲低顯著增加ES耐受性，而STEAP4過表達(dá)顯著增強(qiáng)ES敏感性，且該效應(yīng)可被TTM完全逆轉(zhuǎn)，確立了銅依賴性機(jī)制。STEAP4-OE增加細(xì)胞內(nèi)銅氧化還原通量，尤其顯著促進(jìn)線粒體Cu?積累，同時升高T-GSH水平。ES處理后，STEAP4-OE細(xì)胞表現(xiàn)出FDX1、DLAT、LIAS及脂酰化DLAT減少、HSP70升高的典型銅死亡標(biāo)志，DLAT寡聚化和焦點形成增加，這些變化均被TTM逆轉(zhuǎn)。遺傳學(xué)實驗顯示，FDX1敲除（FDX1-KO）可部分削弱STEAP4-OE的致敏效應(yīng)，而STEAP4-OE也可部分緩解FDX1-KO導(dǎo)致的過度敏感，提示二者存在功能交叉而非簡單冗余。此外，STEAP4-OE抑制克隆形成、增強(qiáng)ES抗增殖活性，并上調(diào)E-cadherin、下調(diào)Vimentin，提示EMT特征減弱。綜上，STEAP4通過增強(qiáng)線粒體銅氧化還原重塑和誘導(dǎo)典型銅死亡標(biāo)志，以銅依賴性方式強(qiáng)化ES觸發(fā)的銅死亡。

4. STEAP4協(xié)調(diào)線粒體代謝重編程以賦予HBx表達(dá)HCC細(xì)胞銅死亡抵抗

銅死亡優(yōu)先殺傷線粒體呼吸依賴型細(xì)胞，而糖酵解偏向型細(xì)胞敏感性較低。HBx表達(dá)模型（HepG2細(xì)胞和HBx-Tg小鼠肝組織）的代謝組學(xué)分析顯示糖酵解/磷酸戊糖途徑（PPP）相關(guān)代謝物增加、TCA循環(huán)中間產(chǎn)物減少，提示代謝向糖酵解狀態(tài)轉(zhuǎn)變。STEAP4-OE的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析則呈現(xiàn)相反模式：銅代謝和銅死亡相關(guān)基因、線粒體電子傳遞鏈（ETC）復(fù)合物和TCA循環(huán)相關(guān)基因上調(diào)，糖酵解通路基因下調(diào)。GO分析顯示"電子傳遞活性正調(diào)控"、"線粒體呼吸鏈"和"4鐵4硫簇結(jié)合"通路激活；KEGG富集突出"氧化磷酸化"和"癌癥中心碳代謝"通路。透射電鏡（TEM）顯示ES處理后STEAP4-OE細(xì)胞線粒體嵴破壞、腫脹和空泡化，線粒體碎片化增加。功能上，ES顯著損害線粒體呼吸鏈復(fù)合物I-V活性，降低TCA相關(guān)代謝物、NAD?/NADH比值和ATP水平。Seahorse分析表明，STEAP4-OE提高基礎(chǔ)和最大呼吸速率，但ES處理后最大呼吸和備用呼吸能力顯著崩潰；同時STEAP4-OE抑制糖酵解參數(shù)。整合OCR/ECAR分析顯示STEAP4-OE使細(xì)胞全局轉(zhuǎn)向線粒體代謝依賴狀態(tài)，這種狀態(tài)對ES觸發(fā)的線粒體衰竭選擇性脆弱。因此，STEAP4將HBx陽性HCC細(xì)胞從糖酵解重編程為TCA循環(huán)/呼吸依賴，從而放大ES-Cu誘導(dǎo)的銅死亡脆弱性。

5. ES和STEAP4協(xié)同增強(qiáng)銅死亡敏感性并在體內(nèi)抑制HBV相關(guān)HCC腫瘤發(fā)生

皮下移植瘤模型（MHCC-97H細(xì)胞，n=5/組）顯示，STEAP4-OE或ES單藥治療均顯著抑制腫瘤生長，二者聯(lián)合產(chǎn)生更顯著的協(xié)同抑制效應(yīng)。聯(lián)合治療組腫瘤內(nèi)Cu2?升高，TEM顯示線粒體超微結(jié)構(gòu)缺陷（嵴丟失、空泡化）最顯著，ETC活性降低，TCA代謝物、NAD?/NADH比值和ATP產(chǎn)生減少，銅死亡和EMT標(biāo)志改變最大。原位肝癌模型（HepG2.2.15-Luc細(xì)胞，n=6/組）進(jìn)一步驗證，ES或STEAP4-OE單藥顯著減少腫瘤負(fù)荷、肝內(nèi)結(jié)節(jié)數(shù)和局部播散，聯(lián)合治療產(chǎn)生穩(wěn)健的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。綜上，STEAP4-OE通過銅死亡抑制HBV相關(guān)HCC，并與ES協(xié)同實現(xiàn)更優(yōu)的抗腫瘤效果。

6. SIRT3介導(dǎo)的STEAP4去乙酰化調(diào)控其在HBx表達(dá)HCC細(xì)胞中的線粒體轉(zhuǎn)位

免疫熒光和線粒體分級分離顯示，anti-HBx中和HBx后STEAP4線粒體定位顯著恢復(fù)。通過Co-IP/質(zhì)譜分析STEAP4相互作用組，GO富集顯示"糖酵解過程"、"丙酮酸代謝過程"、"線粒體"和"ATP結(jié)合"通路；PTM富集突出乙酰化相關(guān)蛋白，提示賴氨酸乙酰化調(diào)控STEAP4相互作用和亞細(xì)胞定位。煙酰胺（NAM，Sirtuin抑制劑）顯著增加STEAP4乙酰化，而HDAC抑制劑TSA作用微弱，表明STEAP4去乙酰化主要由Sirtuin軸調(diào)控。IP-MS鑒定出SIRT3（線粒體去乙酰化酶）為關(guān)鍵候選。SIRT3激動劑honokiol（HKL）減少STEAP4乙酰化并增強(qiáng)SIRT3-STEAP4在線粒體組分中的結(jié)合。上游乙酰轉(zhuǎn)移酶篩選將ELP3確定為STEAP4的主要生理乙酰轉(zhuǎn)移酶。鄰近連接分析（PLA）和共聚焦成像證實SIRT3與STEAP4空間鄰近，anti-HBx顯著增加STEAP4-SIRT3 PLA焦點數(shù)量。Co-IP證實anti-HBx增強(qiáng)STEAP4-SIRT3相互作用及其在線粒體斑點中的共定位。HBx阻斷減少STEAP4乙酰化并增強(qiáng)STEAP4-SIRT3復(fù)合物的線粒體關(guān)聯(lián)，表明HBx拮抗SIRT3依賴性去乙酰化從而破壞STEAP4線粒體輸入。通過STEAP4截短/缺失突變體分析，將關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域縮小至C末端395-459氨基酸殘基。等溫滴定量熱法（ITC）直接定量證實SIRT3與STEAP4結(jié)合，缺失C末端顯著降低結(jié)合親和力。綜上，HBx通過干擾ELP3/SIRT3乙酰化開關(guān)使STEAP4趨向乙酰化，破壞其線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，損害線粒體代謝穩(wěn)態(tài)，最終增加銅死亡脆弱性。

7. STEAP4-K404去乙酰化啟動銅死亡并在原位HCC模型中增強(qiáng)ES療效

計算機(jī)模擬對接預(yù)測Lys333和Lys404為STEAP4中潛在的SIRT3相互作用殘基。線粒體組分SIRT3免疫沉淀物的質(zhì)譜鑒定Lys404（K404）為主要乙酰化位點，且該位點跨物種進(jìn)化保守。研究團(tuán)隊構(gòu)建了STEAP4-WT、乙酰化模擬突變體K404Q和去乙酰化模擬突變體K404R。與WT相比，K404Q表現(xiàn)出基礎(chǔ)乙酰化增加、SIRT3結(jié)合減少、線粒體定位受損；K404R則呈現(xiàn)相反表型。功能上，K404Q削弱ES誘導(dǎo)的銅死亡，而K404R顯著致敏HBx表達(dá)HCC細(xì)胞對ES的反應(yīng)。原位腫瘤模型（HepG2.2.15-Luc，n=6/組）顯示，K404Q腫瘤對ES耐藥，表現(xiàn)為更高的生物發(fā)光信號、更大的腫瘤體積和更多的肝內(nèi)結(jié)節(jié)；K404R腫瘤則對ES超敏感，腫瘤負(fù)荷顯著降低。機(jī)制上，K404乙酰化狀態(tài)決定腫瘤內(nèi)Cu2?豐度和銅死亡信號：K404Q腫瘤積累更多Cu2?但表現(xiàn)為銅死亡抵抗特征（FDX1、DLAT、脂酰化DLAT和LIAS減少，HSP70升高），K404R腫瘤則呈現(xiàn)相反模式。組織病理學(xué)和IHC分析證實了腫瘤侵襲性和增殖活性的差異。綜上，SIRT3介導(dǎo)的STEAP4-K404去乙酰化是功能性啟動銅死亡通路和對ES產(chǎn)生充分治療反應(yīng)的必要且充分條件。

8. Honokiol通過SIRT3-STEAP4依賴性銅死亡發(fā)揮抗腫瘤活性

Honokiol（HKL）是一種天然SIRT3激動劑，可恢復(fù)線粒體氧化磷酸化并逆轉(zhuǎn)Warburg效應(yīng)。HKL處理HepG2.2.15細(xì)胞的RNA-seq顯示核心銅死亡基因（PDHB、STEAP4、LIAS、LIPT1、FDX1、DLD、DLAT）顯著上調(diào)，氧化磷酸化、TCA循環(huán)、線粒體電子傳遞鏈和鐵硫簇通路激活。PPI網(wǎng)絡(luò)將SIRT3-STEAP4軸定位為連接線粒體代謝與銅死亡調(diào)控的中心節(jié)點。shRNA介導(dǎo)的STEAP4敲低（shSTEAP4）消除了HKL誘導(dǎo)的SIRT3-STEAP4鄰近PLA焦點增加和線粒體STEAP4轉(zhuǎn)位。TEM顯示HKL增加線粒體質(zhì)量和嵴完整性，這些益處被STEAP4敲低逆轉(zhuǎn)。Seahorse分析表明HKL增強(qiáng)基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸和備用呼吸能力，而shSTEAP4細(xì)胞無反應(yīng)；HKL抑制基礎(chǔ)糖酵解和糖酵解儲備也依賴STEAP4。HKL聯(lián)合ES顯著增強(qiáng)HBx表達(dá)HCC細(xì)胞的銅死亡，該效應(yīng)被STEAP4敲低顯著削弱。HKL還抑制克隆存活和EdU摻入，增強(qiáng)ES抗增殖活性，上調(diào)E-cadherin、下調(diào)Vimentin。原位肝癌模型中，HKL+ES聯(lián)合方案比ES單藥產(chǎn)生顯著更強(qiáng)的抗腫瘤效果，表現(xiàn)為更低的生物發(fā)光信號和減弱的腫瘤進(jìn)展。機(jī)制上，聯(lián)合治療升高腫瘤內(nèi)Cu2?并誘導(dǎo)銅死亡對齊的蛋白特征，伴隨HSP70誘導(dǎo)；STEAP4基因敲除逆轉(zhuǎn)這些效應(yīng)。綜上，HKL通過SIRT3-STEAP4軸重編程線粒體生物能量學(xué)，增強(qiáng)ES觸發(fā)的銅死亡，是恢復(fù)HBV相關(guān)HCC線粒體脆弱性的合理代謝輔助策略。

三、研究結(jié)論

本研究首次揭示HBx通過破壞線粒體SIRT3-STEAP4軸賦予HBV相關(guān)HCC銅死亡抵抗的分子機(jī)制。主要結(jié)論如下：

HBx-SIRT3-STEAP4調(diào)控軸：HBx抑制SIRT3表達(dá)，損害STEAP4在Lys404位點的去乙酰化，阻止其線粒體定位，導(dǎo)致細(xì)胞從TCA循環(huán)呼吸轉(zhuǎn)向糖酵解，降低對銅離子載體ES的敏感性。

STEAP4的代謝調(diào)控作用：STEAP4是HBV相關(guān)HCC中銅代謝和銅死亡敏感性的關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)。恢復(fù)STEAP4表達(dá)可將腫瘤細(xì)胞代謝從糖酵解重編程為氧化磷酸化/TCA循環(huán)依賴，從而放大銅死亡脆弱性。

治療策略：STEAP4過表達(dá)與ES聯(lián)合在體內(nèi)外產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)；SIRT3天然激動劑Honokiol（HKL）通過恢復(fù)STEAP4線粒體定位增強(qiáng)ES療效，為HBV相關(guān)HCC的銅死亡導(dǎo)向聯(lián)合治療提供了臨床前依據(jù)。

PTM調(diào)控新機(jī)制：首次證明SIRT3直接去乙酰化STEAP4的K404位點是調(diào)控其線粒體轉(zhuǎn)位和銅死亡功能的關(guān)鍵開關(guān)，揭示了一種新的病毒利用翻譯后修飾逃逸內(nèi)在細(xì)胞死亡程序的策略。

Du ZB, Wu XM, Lei JM, Cai YX, He J, Qian B, He XX, Han WH, Lu Y, Xia XG, Zheng HY, Guo DB, Yao YL, Li WG, Lin YC, Lin ZN. SIRT3 deacetylates STEAP4 to modulate cuproptosis sensitivity via mitochondrial metabolic reprogramming in HBV-related HCC. Cell Death Differ. 2026 Mar 16. doi: 10.1038/s41418-026-01713-w. Epub ahead of print. PMID: 41840161.