《Hepatology》解讀：STK24-MASTL-YBX1-PAK4軸——肝細胞癌侖伐替尼耐藥的新機制

? 研究背景

肝細胞癌（HCC）是全球最常見且致死率最高的惡性腫瘤之一，主要由慢性肝病和肝硬化引起。盡管系統(tǒng)治療取得了進展，但晚期HCC的預(yù)后仍然很差。侖伐替尼（Lenvatinib）作為一種多激酶抑制劑，通過靶向VEGFR、FGFR、PDGFR和RET等多種激酶發(fā)揮抗腫瘤作用，已成為HCC的一線治療藥物。然而，侖伐替尼的療效常因腫瘤產(chǎn)生耐藥性而受限，僅能延長患者數(shù)月的生存期。因此，闡明侖伐替尼耐藥的分子機制對于改善臨床結(jié)局和發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點至關(guān)重要。

微管相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶樣蛋白（MASTL）是一種AGC家族激酶，最初在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，通過抑制蛋白磷酸酶2A復(fù)合物（PP2A）調(diào)控細胞周期進程和有絲分裂。近年研究表明，MASTL在多種癌癥中促進腫瘤進展和治療耐藥，如乳腺癌的放射耐藥、結(jié)腸癌的化療耐藥以及口腔鱗狀細胞癌的順鉑耐藥。然而，MASTL作為激酶在耐藥相關(guān)信號通路中的作用研究較少。本研究旨在探索MASTL在HCC侖伐替尼耐藥中的具體機制，并尋找克服耐藥的新策略。

? 研究結(jié)果

2.1 整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示MASTL在侖伐替尼耐藥的HCC細胞和組織中高表達

研究者建立了兩株侖伐替尼耐藥細胞系（PLC/PRF/5-R和MHCC97H-R），通過IC50測定、克隆形成實驗和細胞活力檢測確認其耐藥性。同時，獲取了6例侖伐替尼耐藥或敏感患者的活檢樣本。轉(zhuǎn)錄組測序和蛋白質(zhì)組測序分析顯示，在耐藥細胞和組織中有7個共同上調(diào)基因，其中MASTL因其與多種治療耐藥相關(guān)而被選為研究對象。進一步驗證表明，MASTL在耐藥細胞和組織中表達顯著升高。研究者還構(gòu)建了獨特的藥物治療組織芯片，包含52例侖伐替尼治療患者的手術(shù)樣本，免疫組化結(jié)果顯示MASTL高表達的患者中疾病穩(wěn)定（SD）比例更高，且分層生存分析顯示MASTL高表達的侖伐替尼治療患者預(yù)后更差。這些結(jié)果突出了MASTL在侖伐替尼耐藥中的潛在重要性。

2.2 MASTL過表達與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)

利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析，研究者發(fā)現(xiàn)包括HCC在內(nèi)的多種癌癥中MASTL在腫瘤組織中的表達高于正常組織。HCC患者中MASTL高表達與更短的總生存期（OS）相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)通過5對HCC樣本及配對正常組織的qRT-PCR和免疫印跡實驗得到驗證。在TMA1和TMA2隊列中，MASTL高表達與惡性表型和不良預(yù)后相關(guān)，AUC值為0.836，表明其具有較高的診斷準確性。多變量Cox回歸分析顯示，MASTL高表達是OS和無病生存期（DFS）的獨立預(yù)測因子。因此，MASTL成為與HCC不良預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因。

2.3 MASTL促進HCC細胞侖伐替尼耐藥和體內(nèi)外進展

MASTL在不同HCC細胞系中的表達水平與侖伐替尼IC50值呈強正相關(guān)。通過構(gòu)建MASTL過表達和敲低的慢病毒載體，研究者發(fā)現(xiàn)MASTL過表達降低細胞對侖伐替尼的敏感性，而MASTL敲低則增強敏感性。MASTL過表達還促進細胞遷移、侵襲和自我更新能力。體內(nèi)成瘤實驗表明，MASTL敲低顯著抑制腫瘤生長和侖伐替尼耐藥，而MASTL過表達則增強腫瘤生長和耐藥。RNA測序的KEGG分析顯示MASTL高表達激活MAPK信號通路，GO分析顯示其與細胞生長調(diào)控相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明MASTL通過調(diào)控MAPK信號通路顯著促進腫瘤生長并賦予侖伐替尼耐藥。

2.4 MASTL通過促進YBX1的磷酸化和核轉(zhuǎn)位促進侖伐替尼耐藥

通過免疫共沉淀和質(zhì)譜分析，研究者在耐藥細胞中鑒定了MASTL的相互作用蛋白，并與已發(fā)表的MASTL相互作用數(shù)據(jù)集交叉比對，最終確定Y-box結(jié)合蛋白1（YBX1）為關(guān)鍵底物。LC-MS/MS數(shù)據(jù)、銀染和免疫印跡驗證了MASTL與YBX1的結(jié)合。通過構(gòu)建截短質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)YBX1的Ala/Pro富集N端（AP）結(jié)構(gòu)域和冷休克結(jié)構(gòu)域（CSD）負責(zé)與MASTL相互作用。鑒于YBX1在S102位點的磷酸化（p-YBX1）是其活性形式，研究者發(fā)現(xiàn)MASTL表達變化直接影響p-YBX1水平和YBX1穩(wěn)定性。耐藥細胞中YBX1磷酸化顯著增加，免疫熒光顯示MASTL與p-YBX1在MASTL過表達細胞的細胞核中強烈共定位。核質(zhì)分離實驗進一步證實MASTL過表達與YBX1在細胞核中的過度磷酸化相關(guān)。通過敲除YBX1并轉(zhuǎn)染S102突變體（YBX1-S102A），發(fā)現(xiàn)MASTL誘導(dǎo)的侖伐替尼耐藥在YBX1敲除后降低，且不能被突變YBX1的重新表達所逆轉(zhuǎn)，表明YBX1的磷酸化對MASTL介導(dǎo)的耐藥至關(guān)重要。

2.5 磷酸化YBX1通過轉(zhuǎn)錄激活PAK4促進侖伐替尼耐藥

為鑒定YBX1的靶基因，研究者進行了RNA測序和染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實驗。結(jié)果顯示MASTL高表達激活YBX1的轉(zhuǎn)錄功能，在基因組轉(zhuǎn)錄起始位點附近鑒定出更多YBX1結(jié)合區(qū)域。通過RNA-seq與ChIP-seq數(shù)據(jù)交叉，獲得28個重疊基因，其中p21激活激酶4（PAK4）因其在調(diào)控細胞存活和耐藥中的作用被選為研究對象。ChIP-seq結(jié)果顯示YBX1在PAK4啟動子區(qū)域顯著富集。熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻?/font>PAK4啟動子的-1500至-1000區(qū)域足以介導(dǎo)YBX1的轉(zhuǎn)錄激活，該區(qū)域內(nèi)4個推定的YBX1結(jié)合位點中，a、b、c位點的突變部分降低YBX1介導(dǎo)的PAK4啟動子活性，而聯(lián)合突變完全消除該活性。在YBX1敲除的MASTL過表達細胞中恢復(fù)PAK4表達，部分挽救了侖伐替尼耐藥的降低，并幫助MASTL重新激活MAPK信號通路。這些結(jié)果表明PAK4是MASTL介導(dǎo)侖伐替尼耐藥的關(guān)鍵效應(yīng)分子。

2.6 應(yīng)激激活的STK24導(dǎo)致MASTL在S875位點的磷酸化和激活

MASTL在T194、T299和S875位點存在保守的磷酸化位點。通過丙氨酸突變實驗，發(fā)現(xiàn)S875突變顯著損害MASTL磷酸化YBX1的能力，表明S875對MASTL的激酶活性至關(guān)重要。S875突變還降低細胞對侖伐替尼的耐藥性，并阻止MASTL的核轉(zhuǎn)位。將LC-MS/MS免疫共沉淀數(shù)據(jù)與常見人類絲氨酸/蘇氨酸激酶列表交叉比對，鑒定出絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶24（STK24，也稱MST3）是唯一候選激酶。免疫熒光和免疫共沉淀顯示MASTL與STK24存在結(jié)合相互作用。STK24在氧化應(yīng)激和缺氧條件下被磷酸化激活，而侖伐替尼處理以劑量和時間依賴的方式激活STK24磷酸化。由于缺乏MASTL S875位點的磷酸化特異性抗體，研究者通過監(jiān)測MASTL的核定位間接評估其磷酸化程度。STK24敲低顯著降低MASTL核轉(zhuǎn)位的效率，表明STK24確實影響MASTL S875的磷酸化。這些發(fā)現(xiàn)突出了S875對MASTL功能的關(guān)鍵重要性，并提示侖伐替尼可能通過STK24調(diào)控MASTL磷酸化。

2.7 靶向MASTL的MKI-1通過抑制MASTL/YBX1/PAK4軸增強侖伐替尼的體內(nèi)療效

臨床樣本證實，野生型YBX1和磷酸化YBX1在HCC組織中顯著高于配對正常組織，且其表達與HCC預(yù)后負相關(guān)。TMA1隊列中MASTL、YBX1、p-YBX1和PAK4高表達頻繁共存，且疾病進展（PD）患者相比部分緩解（PR）患者呈現(xiàn)過度激活的MASTL/YBX1/PAK4軸。鑒于該軸在侖伐替尼耐藥中的關(guān)鍵作用和MASTL的核心調(diào)控地位，研究者選擇MASTL抑制劑MKI-1阻斷該軸。免疫印跡顯示MKI-1以劑量和時間依賴的方式抑制MASTL/YBX1/PAK4軸的激活。使用侖伐替尼耐藥患者的腫瘤標(biāo)本構(gòu)建PDX模型，MKI-1處理顯著抑制耐藥腫瘤生長。在皮下和原位移植瘤模型中，雖然單用侖伐替尼效果有限，但MKI-1或PAK4抑制劑CZh226聯(lián)合侖伐替尼顯著抑制腫瘤生長，且MKI-1聯(lián)合侖伐替尼的療效優(yōu)于其他治療組合。此外，聯(lián)合治療未引起體重變化或明顯副作用。在5例MASTL高表達患者來源的PDX模型中，聯(lián)合治療同樣顯著抑制腫瘤生長。

? 研究結(jié)論

本研究揭示了MASTL/YBX1/PAK4信號軸是驅(qū)動HCC侖伐替尼耐藥和腫瘤進展的關(guān)鍵機制。侖伐替尼暴露下，應(yīng)激激活的STK24磷酸化MASTL的S875位點，激活MASTL的激酶功能；活化的MASTL進而磷酸化YBX1的S102位點，促進其核轉(zhuǎn)位并激活轉(zhuǎn)錄因子功能；磷酸化YBX1轉(zhuǎn)錄激活PAK4，通過MAPK信號通路促進細胞存活和增殖，最終導(dǎo)致侖伐替尼耐藥。靶向抑制該軸（特別是使用MASTL抑制劑MKI-1）可在體內(nèi)外模型中顯著增強侖伐替尼的療效，為克服HCC侖伐替尼耐藥和改善患者臨床結(jié)局提供了潛在的新型治療策略。未來研究應(yīng)聚焦于開發(fā)強效MASTL抑制劑，并在臨床環(huán)境中評估其療效，以確認其在減輕侖伐替尼耐藥方面的潛力。

? 研究思路

該研究遵循"現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)→機制探索→功能驗證→轉(zhuǎn)化應(yīng)用"的經(jīng)典研究范式：

1.臨床問題出發(fā)：針對HCC侖伐替尼耐藥的臨床難題，建立耐藥細胞系和獲取患者樣本；

2.組學(xué)篩選靶點：通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)整合分析，篩選出關(guān)鍵耐藥基因MASTL；

3.臨床相關(guān)性驗證：利用TCGA數(shù)據(jù)庫、臨床樣本和組織芯片，驗證MASTL與HCC預(yù)后和侖伐替尼療效的關(guān)系；

4.功能機制研究：通過體內(nèi)外實驗明確MASTL促進耐藥和腫瘤進展的功能，并深入解析其下游分子機制——MASTL→YBX1磷酸化/核轉(zhuǎn)位→PAK4轉(zhuǎn)錄激活→MAPK通路激活；

5.上游調(diào)控機制：發(fā)現(xiàn)STK24作為應(yīng)激響應(yīng)激酶，在侖伐替尼刺激下激活并磷酸化MASTL的S875位點，啟動整個信號軸；

6.轉(zhuǎn)化應(yīng)用驗證：使用MASTL抑制劑MKI-1和PAK4抑制劑CZh226，在多種體內(nèi)模型（皮下瘤、原位瘤、PDX模型）中驗證聯(lián)合用藥克服耐藥的效果，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

Liang BG, Zheng YM, Xu MH, Gao C, Xu WX, Chen JB, Wang SW, Zhao LT, Yang GH, Yuan L, Ma AY, Dong ZN, Cai JB, Sun HC, Ke AW, Shen YH. The MASTL/YBX1/PAK4 axis regulated by stress-activated STK24 triggers lenvatinib resistance and tumor progression in HCC. Hepatology. 2026 Apr 1;83(4):771-788. doi: 10.1097/HEP.0000000000001392.